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何廣勝主任醫(yī)師 江蘇省人民醫(yī)院 血液內(nèi)科 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH）是一種或幾種造血干細胞X染色體上PIG-A基因突變使GPI錨鏈蛋白合成受阻，引發(fā)細胞膜上錨鏈的一組膜蛋白丟失，補體活化異常所致的造血功能衰竭癥。Flaer檢測法提高了診斷的敏感性，為PNH的早發(fā)現(xiàn)、早治療打下了良好的基礎。PNH的血栓形成、肺動脈高壓、慢性腎功能不全等非典型癥狀較前受到了更多關注。Eculizumab治療改變了PNH整個治療面貌，異基因造血干細胞移植作為PNH的惟一治愈手段亦有進展。1 Flaer診斷 流式細胞術(shù)是診斷PNH的金標準，并可以對PNH血細胞進行定量分析。隨著研究的不斷深入，人們已經(jīng)注意到了傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)對于PNH克隆檢測的局限性。CD55、CD59等一些補體調(diào)節(jié)蛋白的表達還會受到其它因素的影響，如MDS、細胞發(fā)育不全或炎癥反應等均有可能導致膜蛋白的缺失[1]。在這種情況下人們找到了FLAER分析法來補其不足。FLAER試劑是一種嗜水氣單胞菌毒素的變體，從患暴發(fā)性傳染病的鯽魚中分離出嗜水氣單胞菌株，該菌株培養(yǎng)的上清液中可分離到嗜水氣單胞菌毒素，對其進行滅活等處理得到FLAER試劑。FLAER分析法對診斷的敏感性和特異性都有所增加。有文獻報道[2]FLAER對PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它靶向標記檢出率的敏感性為1%；FLAER可以特異地與細胞膜上的GPI錨蛋白結(jié)合，可直接反應錨蛋白的缺失情況，而PNH本身就是由于GPI錨蛋白合成異常所致的疾病，其它靶向標記只是單純與錨鏈的抗原特異性結(jié)合，且這些抗原的表達不穩(wěn)定，還會受到其它因素的影響，因此FLAER診斷的特異性與其它靶向標記相比較而言有所提高。由于紅細胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好的與錨蛋白結(jié)合，F(xiàn)LAER分析法一般只用于粒細胞和單核細胞的檢測，且不受溶血與輸血的影響[1]。有文獻報道[3]了536例疑似PNH患者FLAER分析法與傳統(tǒng)流式分析法對比結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FLAER分析法63例患者檢測到了PNH克隆，檢出率11.8%，并且克隆數(shù)都較大，不受溶血和輸血的影響；而傳統(tǒng)分析法只有33例患者被檢測出有PNH克隆，檢出率6.2%，檢測出的克隆數(shù)都較小，很容易受到溶血和輸血的影響。Battiwalla[2]等的對PNH患者多參數(shù)流式細胞術(shù)診斷進行了對比研究，靶向標記分別為：粒細胞FLAER、CD55、CD16，單核細胞FLAER、CD55、CD14，每個細胞系的靶向標記分別兩兩組合，研究的結(jié)果顯示FLAER+CD55對粒系及單核系的PNH克隆的檢出率最高。此文獻還分析了單獨應用CD16、CD14對粒系、單核系PNH克隆的檢出率≥1%，單獨應用FLAER粒系、單核系PNH克隆的檢出率≥0.1%?？紤]到FLAER技術(shù)對PNH診斷的敏感性和特異性都有所增加，因此對于PNH小克隆的監(jiān)測已不再是問題。綜合近年來多篇文獻，對多參數(shù)流式診斷監(jiān)測PNH小克隆意義總結(jié)如下：①PNH患者移植后微小殘留病灶及嵌合狀態(tài)的監(jiān)測。移植有效PNH克隆會逐漸減小，移植無效或移植后復發(fā)PNH克隆會變化不明顯或克隆增大。移植后嵌合狀態(tài)好，F(xiàn)LAER與其它靶向標記會同向運動，既二者同時減小。反之，二者反向運動，既相互矛盾。移植有效使GPI錨蛋白正常表達，單純FLAER分析法檢測不到錨蛋白的缺失。CD55、CD16、CD14等錨鏈蛋白受到炎癥、嵌合狀態(tài)等因素的影響而表達缺失，并不是錨蛋白異常引起的其表達缺失。因此，單獨FLAER分析法更能反映PNH患者移植后PNH克隆動態(tài)變化情況，二者結(jié)合分析更能反映機體的嵌合狀態(tài)。②反應免疫抑制治療效果。AA或MDS患者接受免疫抑制治療骨髓狀況改善后PNH克隆會逐漸減小。AA-PNH綜合征患者接受強化免疫抑制治療后，骨髓處于抑制期時，PNH克隆有可能會因獲得生存優(yōu)勢而增大。PNH紅細胞克隆的監(jiān)測，國際上首推CD59，但 Hchsmann[4]等對CD58、CD59對網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞PNH克隆檢測的對比研究顯示，前者的敏感性高于后者，檢出的PNH克隆前者大于后者。對哪些患者要進行PNH的篩查呢？PNH診斷指南[5]建議對Coombs試驗陰性或伴鐵缺乏的溶血性貧血、血紅蛋白尿、再生障礙性貧血、難治性貧血、不明原因血栓形成或少見部位血栓形成、血栓與溶血共存、不明原因血細胞減少尤其是年輕患者都要進行PNH篩查。有文獻報道大約26%的PNH患者由于血紅蛋白尿而被診斷[6]。日本的一項研究表明大約有45%的PNH患者有AA或MDS病史[7]。70%的AA患者可以檢測出PNH克隆，細胞數(shù)通常小于10%，偶爾也可見到大克隆，經(jīng)研究證實這部分患者確實存在PIG-A基因突變。由MDS轉(zhuǎn)變?yōu)镻NH的患者有以下特點：難治性貧血、骨髓增生低下、HLA-DR陽性、遺傳學正常、中重度血小板減少、對免疫抑制治療效果好。對免疫治療敏感的患者可能存在誤診的可能性，是AA而非MDS，事實上AA轉(zhuǎn)變?yōu)镻NH較常見，而MDS轉(zhuǎn)變?yōu)镻NH很少見[8]。MDS患者也可檢測到錨鏈蛋白的缺失，是否存在PIG-A基因突變?nèi)杂写M一步研究[8]。2 臨床癥狀2.1血栓形成 血栓事件是PNH患者的主要死因，動靜脈均可發(fā)生。PNH患者血栓形成是多因素共同作用的結(jié)果，PNH患者補體活化及溶血過程中釋放一些物質(zhì)，如C5a，可使機體處于一種潛在的炎癥狀態(tài)下[7]9，炎癥可使單核細胞、血管內(nèi)皮細胞過度表達及釋放組織因子，而啟動凝血過程。炎癥又可以和凝血系統(tǒng)相互作用，炎癥因子加重凝血異常，凝血異常又可加劇炎癥反應，形成惡性循環(huán)。炎癥介質(zhì)可破壞內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞活化增加，大量組織因子釋放入血啟動外源性凝血途徑。有文獻報道CD55CD59缺乏的血小板更易被活化或NO的消耗促使血小板活化增加[10]、聚集粘附形成血栓。血管內(nèi)溶血使游離血紅蛋白累積，血液黏滯度增加，也可能由于血紅蛋白沉積在血小板上影響血小板的功能[11]使血液始終處于一種高凝或血栓前狀態(tài)。靜脈血栓多發(fā)于深靜脈、肺，肝靜脈、腸系膜靜脈、皮膚靜脈血栓相對少見[9]。臨床表現(xiàn)多樣，如組織器官的淤血、缺氧、肺動脈高壓、呼吸困難、布加綜合癥等。動脈血栓常發(fā)生在腦動脈、冠狀動脈，以腦缺血及急性心肌梗死為主要臨床表現(xiàn)。PNH患者合并動脈血栓者較少見，這部分患者中以中青年占多數(shù) [12]。40%的PNH患者可能會發(fā)生血栓事件，這些患者中大約40%～67%死于血栓事件[13]。PNH患者血栓形成往往預后不良，一次血栓事件的發(fā)生將會使PNH的死亡率增加5～10倍[13]。血栓形成風險大小可以通過一些客觀指標來判斷，從而可以采取有效的措施來預防血栓事件的發(fā)生。許多文獻已經(jīng)報道[14]了血栓事件的發(fā)生可能與PNH粒細胞克隆數(shù)有關，PNH粒細胞大于50%，血栓形成的風險明顯增加。粒細胞克隆每增加10%血栓的發(fā)生率就會增加4倍[15]。血栓形成還與輸血史，溶血程度，抗凝治療，血小板數(shù)量有關。28%無輸血史的PNH患者會發(fā)生血栓事件[16]。有大克隆及典型溶血癥狀的PNH患者易形成血栓[15]17。有文獻報道PNH患者抗凝治療會促使新的血栓形成或原有血栓進展 [18]。個別PNH患者接受肝素抗凝治療后會出現(xiàn)肝素誘導的血小板減少癥(HIT)[19]，而接受肝素抗凝治療的患者HIT發(fā)生率為1%～3%，這部分患者中血栓事件的發(fā)生率高達89%。臨床上凡懷疑有血栓形成的PNH患者可以通過彩色多普勒、增強CT、血管造影、MRI等檢測手段反應出來，但造影劑有誘發(fā)溶血及血栓事件的可能而限制了其應用[20]。2.2肺動脈高壓（pulmonary hypertension ，PAH）反復的血管內(nèi)溶血使血液中游離的血紅蛋白增加，血紅蛋白與NO的結(jié)合能力要比氧氣高百倍，NO的消耗增加；溶血或炎癥損傷血管內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮細胞合成的NO減少；溶血可釋放精氨酸酶，合成NO的前體L-精氨酸分解增加，NO合成減少[21]。最終將會導致NO的清除、生物利用度下降。正常機體NO量是PNH患者的6～10倍[22]。而在機體內(nèi)NO有重要的生理作用：調(diào)節(jié)平滑肌功能、平衡血管的舒縮活動、維持器官血流量。基于NO的生理功能，血液中NO含量下降，肺血管平滑肌功能失調(diào)、肺血管阻力增大逐漸形成PAH。據(jù)報道大約有50%的PNH患者有PAH[23]。此外溶血使肺動脈的緊張性增加[22]24、血液的高凝狀態(tài)及肺栓塞也是PAH形成的重要原因。有文獻報道溶血相關的血栓事件極易發(fā)生在肺部[23]，也許與此有關。一項對PNH患者肺動脈高壓的研究提示：60%的患者有亞臨床血栓[25]。呼吸困難是PAH及右心室功能不全典型的臨床表現(xiàn)，66%的患者會出現(xiàn)中重度呼吸困難。衡量PAH的2個重要指標：彩色多普勒和腦鈉肽前體（amino terminal-pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）。BNP的水平與PAH及右心功能不全的程度相關聯(lián)。NT-proBNP（≥160pg/ml）的水平在溶血性貧血患者中是一個判斷病情嚴重程度的重要指標。46.6%的PNH患者NT-proBNP≥160pg/ml [23]。彩色多普勒主要是通過觀察三尖瓣反流量（Tricuspid reverse flow，TRV）來反應PAH，在溶血性疾病中通常TRV＞2.5m/s（相當于肺動脈壓力＞30mmHg），存在PAH 。但是TRV還受到心輸出量等多種因素的影響，對于TRV＞2.5m/s是否真正存在PAH很多文獻提出了質(zhì)疑。Bachir等對96例多普勒證實有PAH的溶血性貧血患者行右心導管測肺壓，只有24例患者肺動脈壓力是增高的[21]。因此，超聲評估PAH存在一定的假陽性率，該指標定在何程度才能更好的反應肺動脈壓力的情況，或者是否需要其它指標的參考仍有待進一步研究。對于有Eculizumab上市的國家并且能夠承擔該藥物長期治療的費用，改善肺動脈高壓及呼吸困難當然首選Eculizumab藥物治療。對于無Eculizumab藥物上市的國家或是由于經(jīng)濟原因不能選擇Eculizumab治療的患者來說，PAH一定要采取綜合治療，如利尿、擴血管（鈣通道阻滯劑、前列環(huán)素類藥物）、強心、抗凝、吸氧等。另外，合理使用鎮(zhèn)靜劑，可預防PAH危象的發(fā)生。2.3慢性腎臟疾?。╟hronic kidney disease ，CKD）慢性腎臟疾病也是多因素共同作用的結(jié)果，反復溶血，血紅蛋白在腎近段小管重吸收，并在近端小管上皮細胞內(nèi)分解為含鐵血黃素，含鐵血黃素沉積在腎小管上皮細胞內(nèi)損傷腎小管；NO的消耗、生物利用度下降使腎臟血管收縮、阻力增大、腎血流量減少、腎臟缺血缺氧；腎臟內(nèi)血栓形成等都會影響到腎臟功能造成急慢性腎損傷。臨床表現(xiàn)：腎小管上皮細胞脫隨尿液排出形成含鐵血黃素尿，腎臟內(nèi)血栓形成引發(fā)側(cè)腰肋痛或腹痛、影像學上可表現(xiàn)為病腎增大，若雙側(cè)腎靜脈主干血栓形成可致急性腎衰，表現(xiàn)為少尿、無尿、血肌酐、尿素氮進行性增高，腎小管功能異常還會出現(xiàn)腎性糖尿、蛋白尿，與溶血相關的嚴重高血壓還可出現(xiàn)腎小球硬化等。PNH患者CKD的發(fā)生率高出常人6.6倍[26]。有文獻[26]對129例PNH患者的報道中得出大約64%的PNH患者存在CKD的并發(fā)癥，43.1%CKD 1-2 期，20.7%CKD 3-5期，35.7%無CKD。存在CKD并發(fā)癥的患者中59%的患者輸血史0-1次[21]，提示血細胞破壞增多會增加CKD的風險。此外，可以看出大部分存在腎臟并發(fā)癥的PNH患者都處于慢性腎病的早期階段，出現(xiàn)3-5期CKD往往提示預后不良，溶血的一系列代謝產(chǎn)物不能及時排出體外，形成惡性循環(huán)最終進展為腎衰竭。有文獻報道[18]，8%～18%的PNH患者死于腎衰竭。若患者出現(xiàn)腎功能不全的癥狀或高度懷疑腎臟有血栓形成時MRI檢出的敏感性較高，有人檢查發(fā)現(xiàn)80%（8/10）的PNH患者MRI提示有腎臟血栓形成的證據(jù)[11]。治療上，在接受Eculizumab治療的同時可輔以利尿劑、糾正電解質(zhì)紊亂等，腎功能損傷嚴重可考慮血液透析。2.4其它 常見的臨床癥狀還有腹痛、吞咽困難、呼吸困難、勃起功能障礙、乏力等，正常的日?；顒訜o法維持，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。究其原因都是由于溶血、NO消耗所引起。3. 治療PNH克隆<10%(AA-PNH、MDS-PNH、亞臨床PNH等)且無癥狀的患者不需要治療，只要定期隨訪即可，6或12個月篩查一次[8]；對于有典型癥狀的患者則需要早期干預治療，骨髓移植和Eculizumab是唯一證明有效的方法，部分患者也可用糖皮質(zhì)激素，但長期應用的毒副作用需要考慮。3.1EculizumabEculizumab是人源型抗補體C5單克隆抗體，補體C5是補體級聯(lián)反應中最后一個酶促反應底物，C5在C5轉(zhuǎn)化酶作用下裂解為C5a和C5b，C5b參與膜攻擊復合物(MAC)C5b-9的形成。Eculizumab是抑制末端補體成分活化的重組人源型單克隆抗體，能特異性與人末端補體蛋白C5結(jié)合，通過抑制補體C5向C5a和C5b的裂解，阻斷炎癥因子C5a的釋放及膜攻擊復合物C5b-9的組成，從而達到控制溶血、減少炎癥反應、減少血栓形成的目的。大量的研究已經(jīng)證明了Eculizumab是治療PNH最安全有效的藥物。Eulizumab可以抑制溶血、減少NO消耗、減少血栓事件的發(fā)生、調(diào)節(jié)血壓、改善肺動脈高壓及呼吸困難等情況。Kelly[27]等對79例接受Eulizumab治療的PNH患者的研究顯示，治療前81%的患者需要輸血支持，治療后66%的人可脫離輸血，治療一年時仍有2/3的患者需要輸血，但輸血間期明顯延長，隨著治療時間的延長，大部分人可脫離輸血依賴。治療前后血栓事件的發(fā)生率分別為5.6%和0.8%，且采取預防性抗凝治療的患者，Eulizumab治療后抗凝治療停止，在隨后的長期觀察中無血栓事件發(fā)生。Hillmen[28]等對195例PNH患者的研究中發(fā)現(xiàn)接受Eulizumab治療的患者血栓發(fā)生率從7.37%降至1.07%，治療后F1+2（凝血酶原片段1+2），D-dimers（D-二聚體），PAP（纖溶酶抗纖溶酶復合物），TAT（凝血酶抗凝血酶復合物）水平都有不同程度的下降[29,30]?？紤]到血栓事件是PNH患者的主要死因并與患者的預后密切相關，因此長期接受Eulizumab治療的患者，死亡率明顯下降，與正常人相比無顯著差異，Kelly[27]等的研究還顯示在Eulizumab治療期間死亡3例，且死因都與本病無關，1例55歲死于轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌，1例76歲有老慢支病史死于肺炎，1例79歲死于心衰。另有文獻報道[23]Eulizumab治療后，LDH、精氨酸酶-1、NO消耗、NT-proBNP在2周內(nèi)明顯改善，治療兩周后溶血、貧血、乏力、呼吸困難、腹痛等癥狀均有不同程度改善。且在治療過程中，患者的血壓明顯下降，收縮壓中位改變-10mmHg，舒張壓中位改變-40mmHg。具體用法：前四周600mg，ivgtt，qw×4次，從第五周開始900mg，ivgtt，兩周一次，若患者的癥狀較重維持劑量可酌情增加。對于Eulizumab的血藥濃度問題，兩周即可達到有效治療濃度，最低有效濃度35ng/ml [31]，治療有效與否可通過監(jiān)測LDH的變化來反映。腦膜炎奈瑟菌感染是Eulizumab治療過程中最嚴重的不良反應，因此用藥前要注射疫苗。其它常見的不良反應按發(fā)生可能性由大到小依次為頭痛、鼻咽炎、惡心、腹瀉、皮疹、發(fā)熱、嘔吐等，這些不良反應在初始治療時較明顯，在治療過程中會逐漸改善[7]。美中不足的是Eulizumab只能控制溶血癥狀，無法徹底治愈PNH，只能抑制血管內(nèi)溶血，無法抑制血管外溶血，有加重血管外溶血的可能性，如膜表面沉積補體C3片段的紅細胞在脾臟破壞增多，最終可致脾臟腫大，有些患者接受治療后網(wǎng)織紅計數(shù)仍然很高可能就是此原因。此外，價格昂貴、終身用藥、定期用藥給患者帶來了極大的經(jīng)濟負擔，患者一旦應用Eculizumab，則需每兩周輸注一次直到患者去世或PNH自發(fā)消失(極少發(fā)生)，若中斷治療，患者隨即出現(xiàn)無法控制的溶血及其并發(fā)癥，后果不容樂觀。Eculizumab雖說是目前治療PNH的首選藥物，但該藥在許多國家還沒有上市，對于這些國家的PNH患者來說只能選擇激素類藥物或其它免疫抑制劑，別無它選。前面已經(jīng)述及Eculizumab的常見不良反應，都只是短期內(nèi)的副作用，長期用藥的不良反應、患者的耐受情況、是否會出現(xiàn)新的基因突變或出現(xiàn)耐藥基因不可預知。3.2異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）BMT是惟一能夠徹底治愈PNH的有效方法，由于Eulizumab藥物的存在及移植相關高死亡率，很多情況下BMT并不是患者的最佳選擇。對于一些無Eulizumab藥物上市的國家，骨髓移植仍然是治療本病的首選方案。綜合文獻對PNH患者骨髓移植適應征總結(jié)如下：①存在PNH引起的嚴重并發(fā)癥，如反復血栓形成，難治性溶血性貧血等。②骨髓衰竭。③Eulizumab藥物治療效果欠佳。非清髓或減低劑量預處理方案適應人群：①年輕患者，對生育有要求。②有臟器功能不全及不能耐受清髓預處理方案者。IEBMT報道的48例接受同胞全相合骨髓移植的PNH患者2年生存率為56%，大部分患者于移植后1年內(nèi)死亡[32]。歐洲血液與骨髓移植小組報道的PNH患者異基因骨髓移植5年存活率70%，移植失敗6%，急慢性GVHD分別為15%和20%[33]。Santarone[34]等對26例PNH骨髓移植患者的報道，其中22例同胞全相合，1例無關供體全相合，1例同胞部分相合，1例無關供體部分相合，1例單倍體（其母），移植失敗8%，移植相關死亡率42%，15例清髓預處理患者中隨訪一年移植相關死亡率26%，1例死于急性GVHD，1例死于慢性GVHD，2例死于感染。11例減低劑量預處理患者一年內(nèi)累計死亡率63%，8例HLA全相合的患者中4例死亡，1例死于移植失敗，1例死于慢性GVHD，1例死于感染，1例死于布加綜合癥。所有移植患者Ⅱ～Ⅳ級急性GVHD累積發(fā)病率42%，15例清髓的患者中，Ⅱ級急性GVHD6例，Ⅲ～Ⅳ級急性GVHD2例；11例減低劑量預處理的患者中，Ⅱ級急性GVHD2例，Ⅲ～Ⅳ級急性GVHD1例。20例長期存活的患者中，慢性GVHD累積發(fā)病率50%，廣泛的慢性GVHD累積發(fā)病率16%。隨訪10年無病生存率57%，23例HLA全相合患者10年無病生存率65%，15例清髓預處理患者10年無病生存率73%。長期存活的15例患者中（11例清髓預處理，4例減低劑量預處理）血液系統(tǒng)恢復正常，無PNH克隆，無血栓事件，無本病的復發(fā)。目前還沒有大宗病例對于同胞骨髓移植、無關供體移植及臍血移植的對比研究。3.3其它治療是否要對PNH患者進行預防性抗凝治療或在Eulizumab治療同時性抗凝治療尚存在爭議，抗凝治療有可能使原有血栓加重或新血栓形成，或肝素誘導的血小板減少癥。因此，臨床醫(yī)生在行抗凝治療前一定要權(quán)衡利弊，充分考慮的有可能出現(xiàn)的各種不利因素，并與患者及家屬充分溝通后再做決定。前面已經(jīng)述及本病主要是由于反復溶血、NO消耗、生物利用度降低、血小板活化增加最終導致血栓形成，從這一連鎖反應人們考慮到能否試圖增加NO的生物利用度（外源性吸入NO或口服精氨酸）而起到治療PNH的作用，這一設想在鐮刀型細胞貧血癥的患者中已經(jīng)證實了其不可行性[26]，典型的PNH是溶血性疾病中紅細胞破壞最嚴重的血管內(nèi)溶血之一，由此可以推測增加NO的生物利用度對PNH患者無效?？傊現(xiàn)laer時代的PNH早期明確診斷、早期進行干預治療已不再是幻想，問題的重點在于什么時機應采取什么樣的治療措施，是否要對該病的診斷及治療進行分層分級、哪些是PNH患者預后不良的高危因素、是否合并其它基因突變類型、是否有必要對疾病的危險程度進行評分仍有待研究。此外，PNH克隆達到多少時需要干預治療、哪些患者需要動態(tài)監(jiān)測目前還沒有統(tǒng)一的標準。在PNH的治療中，Eculizumab雖是一線用藥，但不足之處仍需考慮，如加重血管外溶血，輸注次數(shù)頻繁，輸注計劃嚴格，長期應用不良反應尚不可預知和價格昂貴等。BMT雖能徹底治愈本病但移植相關死亡率高。這些問題也是PNH治療過程中較為棘手的問題，如何應對及很好的解決這些問題并使患者從中獲益最大仍需廣大 臨床工作者的不斷探索與總結(jié)。參考文獻：[1]．Robert A, Brodsky MD. 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